納米制劑的核心突破（三）： 脂質(zhì)體的關(guān)鍵質(zhì)量屬性

引言

在藥物制劑研發(fā)過(guò)程中，質(zhì)量控制是確保藥物安全性和有效性的核心環(huán)節(jié)。隨著基于脂質(zhì)體的藥物遞送系統(tǒng)的不斷發(fā)展，為了規(guī)范化脂質(zhì)體藥物的研發(fā)和上市審批過(guò)程，EMA和FDA均發(fā)布了相關(guān)的技術(shù)指南和要求。FDA發(fā)布的《Liposome Drug Products: Chemistry,Manufacturing,and Controls;Human Pharmacokinetics and Bioavailability;and Labeling Documentation》指出，脂質(zhì)體制劑的理化性質(zhì)包括脂質(zhì)體形態(tài)；結(jié)構(gòu)；表面特征如聚乙二醇(PEG)化；表面電荷；黏度；粒徑和粒徑分布；相轉(zhuǎn)變溫度；藥物包封率與載藥量；體外釋放率；泄露率等，能夠反映藥物的安全性和有效性，理化參數(shù)的改變將會(huì)導(dǎo)致藥物質(zhì)量的變化。EMA發(fā)布的《Reflection paper on the data requirements for intravenous liposomal products developed with reference to an innovator liposomal product》指出，脂質(zhì)體制劑質(zhì)量表征須包含脂質(zhì)體形態(tài)、粒徑分布；藥物包封率（游離/包埋的量）；有關(guān)物質(zhì)；體外釋放率；泄露率；脂質(zhì)雙層相變行為；表面電荷；用于 pH 梯度負(fù)載脂質(zhì)體的內(nèi)部隔室的 pH 值；脂質(zhì)體內(nèi)活性物質(zhì)的物理狀態(tài)和分布等，在脂質(zhì)體制劑的研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中需要建立可靠的方法嚴(yán)格控制其理化參數(shù)尤其是關(guān)鍵質(zhì)量屬性的變化。

國(guó)家藥監(jiān)局藥審中心于2023年10月18日發(fā)布了《脂質(zhì)體藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則》，該指導(dǎo)原則中明確了脂質(zhì)體藥物的質(zhì)量研究與控制包括：鑒別、含量測(cè)定和脂質(zhì)相關(guān)降解產(chǎn)物檢測(cè)、粒徑及其分布、結(jié)構(gòu)和形態(tài)、包封率、表面電荷、脂膜的熱力學(xué)性質(zhì)、包封體積、包封藥物的狀態(tài)、體外藥物釋放和藥物泄漏和其他項(xiàng)目，在開(kāi)發(fā)脂質(zhì)體制劑中須對(duì)上述關(guān)鍵質(zhì)量屬性進(jìn)行研究。顯然，在脂質(zhì)體制劑的研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中需要建立可靠的方法來(lái)嚴(yán)格控制上述的關(guān)鍵質(zhì)量屬性。

包封率

透析法適用于水溶性藥物，通過(guò)半透膜孔徑大小差別實(shí)現(xiàn)分離。該法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，但耗時(shí)較長(zhǎng)，所耗介質(zhì)較多，易造成藥物滲漏。反透析法極大減少透析介質(zhì)用量，較好避免了因稀釋作用導(dǎo)致的脂質(zhì)體泄漏。

其他分離方法還有魚(yú)精蛋白凝聚法、固相萃取法、熒光法等。魚(yú)精蛋白凝聚法只適用于帶負(fù)電及中性的脂質(zhì)體，固相萃取法雖分離效果不錯(cuò)，但實(shí)驗(yàn)方法復(fù)雜，最佳分離條件不易摸索熒光法可在脂質(zhì)體和游離藥物共存狀態(tài)下測(cè)定包封率，無(wú)需分離二者，但一般需引入熒光指示劑，通過(guò)某種熒光反應(yīng)來(lái)計(jì)算包封率。

在實(shí)際應(yīng)用中，需根據(jù)待測(cè)物性質(zhì)和各種測(cè)定方法的特點(diǎn)，選擇最合適的測(cè)定方法 。

根據(jù)待測(cè)物的性質(zhì)和各種測(cè)定方法的特點(diǎn)，總結(jié)出脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法選擇決策樹(shù)，見(jiàn)圖1。

圖1 脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法選擇決策樹(shù)

脂質(zhì)體的粒徑可以從幾十納米到幾十微米不等，這取決于不同的制備方法和實(shí)際應(yīng)用。脂質(zhì)體微粒的大小及其分布是脂質(zhì)體的重要理化特性，對(duì)藥物的載藥量和體內(nèi)行為產(chǎn)生影響，包括細(xì)胞攝取、組織分布和循環(huán)半衰期等。粒徑過(guò)大，會(huì)導(dǎo)致微粒被吞噬的速度加快，循環(huán)時(shí)間縮短；粒徑過(guò)小則藥物包封率降低，釋放加快，滲透性增加。同時(shí)，在脂質(zhì)體的靶向性方面，Joshi等[2]發(fā)現(xiàn)200 nm的陽(yáng)離子脂質(zhì)體比80 nm的陽(yáng)離子脂質(zhì)體的腫瘤組織靶向性更高，這是因?yàn)樵谝欢椒秶鷥?nèi)，較大的顆粒表面積與腫瘤血管內(nèi)皮的黏附作用更大。Ong等[2]研究了脂質(zhì)體粒徑對(duì)灰黃素脂質(zhì)體口服生物利用度的影響，結(jié)果表明，較小尺寸的脂質(zhì)體生物利用度比較大尺寸的脂質(zhì)體高約3倍，但繼續(xù)降低脂質(zhì)體粒徑(400 nm以下)不會(huì)改善藥物的生物利用度。此外，有研究表明不同粒徑的脂質(zhì)體顆粒還會(huì)誘導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)。

脂質(zhì)體的粒徑分布可以通過(guò)多種儀器技術(shù)進(jìn)行分析。對(duì)脂質(zhì)體粒徑的測(cè)定應(yīng)結(jié)合其粒徑范圍選擇合適的方法、測(cè)定條件、粒徑的分布模式等信息，必要時(shí)應(yīng)說(shuō)明選擇的依據(jù)2020年版《中華人民共和國(guó)藥典》中收載了原料藥和制劑的粒度和粒度分布測(cè)定法，包括顯微鏡法、篩分法、激光散射法。對(duì)于單分散的脂質(zhì)體，應(yīng)用廣泛的微粒檢測(cè)技術(shù)包括基于光譜的激光衍射、動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)以及基于顯微成像的掃描電鏡、透射電鏡、原子力顯微鏡等。對(duì)于多分散脂質(zhì)體，可用上述方法結(jié)合分離技術(shù)共同用于脂質(zhì)體尺寸分布的表征，如尺寸排阻色譜、毛細(xì)管電泳技術(shù)等。Singh等[2]采用了一種多光譜的高級(jí)納米顆粒跟蹤技術(shù)，可以準(zhǔn)確測(cè)量50～2 000 nm的多分散樣品中的顆粒大小。

結(jié)構(gòu)和形態(tài)

為確定結(jié)構(gòu)和形態(tài)，可以根據(jù)需要使用冷凍透射電子顯微鏡、原子力顯微鏡、磷核磁共振、小角度X射線(xiàn)散射、小角度中子散射以及濁度檢測(cè)等技術(shù)來(lái)表征脂質(zhì)體的形態(tài)、表面修飾、脂質(zhì)雙分子層的層數(shù)以及聚集狀態(tài)等。如對(duì)于PEG修飾的脂質(zhì)體，可使用小角度X射線(xiàn)散射、電解質(zhì)絮凝等合適的方法檢測(cè)PEG的厚度。圖1顯示了Doxil ? 的冷凍透射電子顯微鏡（cryo-TEM）圖像。箭頭指向一個(gè)被單層膜脂質(zhì)體包裹的多柔比星晶體（細(xì)胞毒性藥物）。在插圖中以更高倍率顯示了同一顆粒，其包裹的晶體結(jié)構(gòu)清晰可辨。晶體中看似無(wú)特征的部分表明晶體可能發(fā)生了扭曲。膜的雙層結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)。另一個(gè)脂質(zhì)體（用箭頭標(biāo)記）包裹了一個(gè)較小的囊泡和一個(gè)多柔比星晶體。

圖 1. Doxil ? 的低溫透射電鏡圖像。箭頭指向封裝在單膜脂質(zhì)體內(nèi)的阿霉素晶體（細(xì)胞毒藥物）。插圖中顯示了相同粒子的更高放大倍數(shù)。封裝晶體的晶體結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)。晶體中看似毫無(wú)特征的部分表明晶體發(fā)生了扭曲。膜的雙層結(jié)構(gòu)解析度很高。另一個(gè)用箭頭指示的脂質(zhì)體封裝了一個(gè)較小的囊泡和一顆阿霉素晶體。[3]

脂質(zhì)體的表面電荷會(huì)影響脂質(zhì)體的聚集、體內(nèi)清除、組織分布及其與細(xì)胞的相互作用。

用帶電荷的脂質(zhì)制備脂質(zhì)體時(shí)，由于靜電斥力的存在，脂質(zhì)體穩(wěn)定性良好，不易發(fā)生聚集。在體內(nèi)，表面電荷也會(huì)影響脂質(zhì)體的腫瘤靶向性和細(xì)胞攝取過(guò)程。由于生物膜的負(fù)電性，陽(yáng)離子脂質(zhì)體能促進(jìn)脂質(zhì)體與生物膜的融合，從而有利于包封藥物的釋放。[2]

一般通過(guò)測(cè)定Zeta電位來(lái)評(píng)估脂質(zhì)體的表面電荷。Zeta電位的測(cè)定值依賴(lài)于測(cè)定條件，如分散介質(zhì)、離子濃度、pH和儀器參數(shù)等，應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)姆椒ê蜏y(cè)試條件。表面電荷的測(cè)定方法通常有電泳法、電滲法及超聲波法，Zeta電位常被用于評(píng)估脂質(zhì)體的表面電荷特征。

脂膜的熱力學(xué)性質(zhì)主要包括脂膜的流動(dòng)性、相變溫度、穩(wěn)定性等。可以通過(guò)差示掃描量熱法或熒光法（如將具有溫度依賴(lài)性熒光光譜的熒光探針插入脂膜）等評(píng)估脂膜的熱力學(xué)性質(zhì)，如放熱和吸熱曲線(xiàn)，以評(píng)估脂質(zhì)雙分子層的相變行為，以及脂膜的流動(dòng)性、均勻性等。

脂質(zhì)體的包封體積是指每摩爾的脂質(zhì)形成脂質(zhì)體后所包封水相的體積，單位為 L/mol，能夠一定程度地反映脂質(zhì)體（尤其是多囊脂質(zhì)體）的載藥能力。怎么測(cè)定？

可采用電鏡、小角度X射線(xiàn)散射和差示掃描量熱法等方法表征包封藥物的物理狀態(tài)，特別是當(dāng)包封藥物的狀態(tài)對(duì)藥物的釋放及泄漏有重要影響時(shí)（如主動(dòng)載藥后，藥物以膠態(tài)或沉淀的形式存在）。

脂質(zhì)體包封藥物狀態(tài)主要有以下幾種：

按藥物溶解特性分類(lèi)

水溶性藥物：通常被包裹在脂質(zhì)體的中心水相內(nèi)。因?yàn)橹|(zhì)體的磷脂雙分子層具有疏水性，而水溶性藥物難以進(jìn)入疏水性的脂質(zhì)雙層，所以會(huì)被限制在脂質(zhì)體內(nèi)部的水相空間中，以分子或離子形式溶解在水相中。

脂溶性藥物：主要包裹在脂質(zhì)體的雙層膜之間，即脂質(zhì)相內(nèi)。脂溶性藥物能夠與磷脂分子的疏水尾部相互作用，從而鑲嵌在脂質(zhì)雙層內(nèi)部，以分子形式分散在脂質(zhì)層中。

兩親性藥物：這類(lèi)藥物既有親水部分又有疏水部分，其疏水部分可嵌入脂質(zhì)雙層中，親水部分則可能朝向脂質(zhì)體的水相或位于脂質(zhì)體表面，在脂質(zhì)體中以一種特殊的定向排列方式存在。

按藥物物理形態(tài)分類(lèi)

分子狀態(tài)：藥物以單個(gè)分子或離子的形式均勻分散在脂質(zhì)體的水相或脂質(zhì)相中，在這種狀態(tài)下，藥物分子與脂質(zhì)體的組成成分之間存在一定的相互作用，如氫鍵、范德華力等，使藥物能夠穩(wěn)定地保持在脂質(zhì)體內(nèi)部。

膠態(tài)：某些藥物在脂質(zhì)體中可能形成膠體狀態(tài)，即藥物分子聚集形成微小的膠體顆粒，均勻分散在脂質(zhì)體的水相或脂質(zhì)相中，這些膠體顆粒的大小通常在納米級(jí)別，其形成可能與藥物的濃度、脂質(zhì)體的組成以及制備條件等因素有關(guān)。

沉淀狀態(tài)：當(dāng)藥物在脂質(zhì)體中的濃度超過(guò)其在脂質(zhì)體內(nèi)部的溶解度時(shí)，藥物可能會(huì)以沉淀的形式存在，沉淀可能會(huì)影響脂質(zhì)體的穩(wěn)定性和藥物的釋放行為。

鑒別、含量測(cè)定和脂質(zhì)相關(guān)降解產(chǎn)物檢測(cè)

包括對(duì)活性成分、結(jié)構(gòu)或功能性成分（包括脂質(zhì)、非脂質(zhì)）進(jìn)行鑒別和含量測(cè)定；還應(yīng)包括對(duì)關(guān)鍵降解產(chǎn)物的定量檢測(cè)（例如溶血磷脂、過(guò)氧化物等）。

磷脂在生產(chǎn)和貯存過(guò)程中容易發(fā)生水解反應(yīng)，產(chǎn)生降解產(chǎn)物溶血磷脂和脂肪酸，在人體正常情況下，溶血磷脂在細(xì)胞膜中的含量≤3%，濃度范圍是12~166μmol·L-1，當(dāng)溶血磷脂濃度過(guò)高時(shí)，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂，產(chǎn)生溶血或細(xì)胞壞死，因此檢測(cè)脂質(zhì)體中膽固醇、磷脂及其降解產(chǎn)物的含量是很有必要的。由于膽固醇和磷脂類(lèi)化合物極性小且無(wú)紫外吸收，不能使用常規(guī)的紫外檢測(cè)器檢測(cè)，文獻(xiàn)中報(bào)道的檢測(cè)方法是采用通用型檢測(cè)器進(jìn)行測(cè)定：示差折光檢測(cè)器（RID）、蒸發(fā)光檢測(cè)器（ELSD）、電噴霧檢測(cè)器（CAD）等。[5]

為了保證不同批次的脂質(zhì)體藥物具有一致的體內(nèi)藥物釋放行為（脂質(zhì)體釋放包封的藥物而發(fā)揮藥物活性的能力）和體內(nèi)外包封穩(wěn)定性（脂質(zhì)體保留包封藥物的能力），應(yīng)建立適用的方法研究脂質(zhì)體在不同條件下（如，不同的pH和溫度、有無(wú)血漿等）的體外藥物釋放和泄漏，以了解可能影響脂質(zhì)體藥物釋放和泄漏的因素。體外釋放和泄漏評(píng)價(jià)方法的設(shè)計(jì)、建立以及研究?jī)?nèi)容的完整性應(yīng)充分考慮脂質(zhì)體藥物的設(shè)計(jì)目的、應(yīng)用方式以及預(yù)期的用途。應(yīng)具有一定的區(qū)分能力且盡量能反映脂質(zhì)體藥物臨床使用前所處環(huán)境和臨床用藥后經(jīng)歷的生理和病理?xiàng)l件。

包括pH值、脂質(zhì)體藥物的藥脂比（定義為 脂質(zhì)體包封藥物占總脂質(zhì)的比例）、脂質(zhì)體藥物混懸液的黏度、無(wú)菌、熱原/細(xì)菌內(nèi)毒素等。

在脂質(zhì)體研發(fā)和生產(chǎn)過(guò)程中，應(yīng)根據(jù)研發(fā)品種的特點(diǎn)，對(duì)《脂質(zhì)體藥物質(zhì)量控制研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中的質(zhì)量控制項(xiàng)進(jìn)行選擇性研究。早期建立并精準(zhǔn)把控關(guān)鍵質(zhì)量屬性，對(duì)于評(píng)估不同批次、不同批量脂質(zhì)體藥物的差異至關(guān)重要。這不僅能確保藥物的安全性、有效性和穩(wěn)定性，還能為企業(yè)的市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力提供有力保障。

下一篇文章將全面解析脂質(zhì)體上市藥物，敬請(qǐng)期待！

參考文獻(xiàn)：

[1] 張藝，杭太俊，宋敏.載藥脂質(zhì)體包封率測(cè)定方法的研究進(jìn)展［J］中國(guó)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2021，52（2）：245–252.

[2]郭文娣，彭玉帥，許卉，陳華等. 脂質(zhì)體制劑制備工藝及質(zhì)量控制研究進(jìn)展. 藥物分析雜志 43.1 (2023): 61-69.

[3]Nsairat H, Khater D, Sayed U, et al. Liposomes: Structure, composition, types, and clinical applications[J]. Heliyon, 2022, 8(5).

[4]Koifman, N., & Talmon, Y. (2021). Cryogenic Electron Microscopy Methodologies as Analytical Tools for the Study of Self-Assembled Pharmaceutics. Pharmaceutics, 13(7), 1015.

[5]《藥物分析雜志》Chin J Pharm Anal 2023，43（1）: formation and control factors of versatile nanocarriers for biomedical and nanomedicine application.

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